植物线粒体DNA提取试剂盒三，说明线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA的提取制备。四，操作步骤准备工作：在DNASEI中加入600ul（50T）或者1100ul（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2-8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间为10min的改为5min，但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。1. 样本采集前处理：无论田间自然生长还是实验室组织培养，采摘前须避光生长24-48小时，以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液，加入0.5% β-巯基乙醇，10ml 植物细胞裂解液加入50ulβ-巯基乙醇，混匀，形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，此溶液可2-8度保存一个月。2. 叶片用蒸馏水清洗2-3次，滤纸吸干，有条件请用液氮研磨叶片1-2克，研磨完后，取800mg左右研磨的叶片粉，加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，混匀。如果无条件（无液氮），请预冷研钵，取洗过的叶片1000mg，用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液，冰上研磨至看不见明显组织块；3. 将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000×g 离心5min；4. 将上清转移到一新的离心管中，在沉淀中加入0.5ml LysisBuffer/β-巯基乙醇溶液，混匀，再次4℃，1000×g 离心5min，取上清；合并两次上清，将上清4℃ 1000×g 再次离心5min。5．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000×g 离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。6. 在线粒体沉淀中加入0.5mL WashBuffer重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g 离心5min；7．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 16,000×g 离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；8. 加入100ul DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10ulDNASEI溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃， 12,000×g 离心5min。尽可能的弃上清，再加入200ulTE 重悬线粒体沉淀，4℃，12,000×g 离心5min，洗去残留的DNA酶。9.得到的沉淀，用200ulTE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10ul  RNaseA。加入200ul线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1-2min，再加入150ul蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃， 12,000×g 离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。10．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚     25:24:1抽提一次，再用  抽提一次，或者直接用  抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的   （如无   ，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10ul核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃， 12,000×g 离心10min。11. 弃上清，再加入1ml  70%乙醇清洗，4℃， 12,000×g 离心5min。重复用70%乙醇洗一次。12. 弃上清，再次离心1min 吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-105min。13．加入20-30ul TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。14. 进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。